Moleculair biologische methoden van onderzoek en het gebruik ervan

Moleculair biologisch onderzoek methoden spelen een belangrijke rol in de moderne geneeskunde, forensische wetenschap, en biologie. Dankzij de vooruitgang in de studie van DNA en RNA, de persoon in staat is het genoom van het organisme verkennen bepalen de verwekker, om het gewenste nucleïnezuur in een mengsel van zuren, enz herkennen

Moleculair-biologische methoden. Wat is het?

Terug in de 70-80 van de wetenschappers was de eerste om te ontcijferen van het menselijk genoom. Deze gebeurtenis gaf de aanzet tot de ontwikkeling van genetische manipulatie en moleculaire biologie. Studie van eigenschappen van DNA en RNA heeft ertoe geleid dat het nu mogelijk om deze nucleïnezuren gebruiken voor het doel van diagnose van ziekte, studie gen.

Bereiding van DNA en RNA

Moleculair biologische diagnostische methoden vereisen uitgangsmateriaal: vaak is dit nucleïnezuur. Er zijn verschillende manieren om deze stoffen uit de cellen van levende organismen te selecteren. Elk heeft zijn voordelen en nadelen, en het moet worden overwogen bij het kiezen van een werkwijze voor het isoleren van nucleïnezuren in zuivere vorm.

1. Bereiding van DNA door Marmur. De werkwijze bestaat uit het behandelen van het mengsel van alcohol stoffen, verkregen precipitaten zuiver DNA. Het nadeel van deze methode is het gebruik van corrosieve stoffen, fenol en chloroform.

2. Isolatie van DNA op de giek. De belangrijkste stof die hier wordt gebruikt - is guanidinethiocyanaat (GuSCN). Het bevordert de afzetting van desoxyribonucleïnezuur op gespecialiseerde substraten, waaruit vervolgens door middel van een speciale buffer kan worden verzameld. Echter GuSCN - een remmer van de TCP en zelfs een kleine portie dat wordt afgezet in DNA tijdens de polymerase kettingreactie, wat belangrijk is bij het werken met nucleïnezuren beïnvloeden.

3. Precipitatie van onzuiverheden. De werkwijze verschilt van de voorgaande doordat de moleculen zich niet dehoksiribonukleinovoy zuur en verontreinigingen worden afgezet. Om dit te doen, gebruik maken van de ionenwisselaars. Het nadeel is dat niet alle stoffen bezinken.

4. Massa screening. Deze methode wordt gebruikt in situaties waarin u niet hoeft te accurate informatie over de structuur van het DNA-molecuul, en de noodzaak om een aantal statistieken te krijgen. De reden is dat de nucleïnezuurstructuur kunnen worden beschadigd bij het hanteren wasmiddelen, met name alkaliën.

Classificatie van onderzoeksmethoden

Alle moleculair-biologische methoden van onderzoek zijn onderverdeeld in drie grote groepen:

1. Amplificatie (gebruikmakend van meerdere enzymen). Dit omvat PCR - polymerase chain reaction, die een belangrijke rol speelt in veel van de diagnostische methoden.

2. Neamplifikatsionnye. Deze groep werkwijzen is direct betrokken bij de werkzaamheden van nucleïnezuurmengsels. Voorbeelden zijn 3 soorten blots, in situ hybridisatie, etc.

3. Methoden gebaseerd op het inzicht van het signaal van de probe-molecuul dat bindt aan een specifieke DNA of RNA probe. Voorbeeld - hybridisatie systeem Hybride Systeem Capture oplossing (HK2).

Enzymen die kunnen worden gebruikt in moleculair biologische methoden van onderzoek

Veel moleculaire diagnostische technieken omvatten het gebruik van uiteenlopende enzymen. Hieronder worden het meest gebruikt:

1. restrictie-enzym - "cut" het DNA-molecuul benodigde onderdelen.

2. DNA polymerase - synthetiseert een dubbelstrengig deoxyribonucleïnezuur molecuul.

3. Reverse transcriptase (reverse transcriptase) - gebruikt om DNA te synthetiseren van een RNA matrijs.

4. DNA ligase - verantwoordelijk voor de vorming van fosfodiester bindingen tussen nucleotiden.

5. exonuclease - verwijdert nucleotiden van de eindgedeelten van de deoxyribonucleïnezuurmolecuul.

PCR - de basismethode van DNA amplificatie

Polymerase-kettingreactie (PCR) wordt algemeen gebruikt in de moderne moleculaire biologie. Deze werkwijze, waarbij een enkel DNA-molecuul een groot aantal kopieën (amplificeren molecuul) kan worden verkregen.

De belangrijkste functies van PCR:

- diagnose van ziekten;

- het kloneren van DNA-segmenten, Gene.

Voor het uitvoeren van de polymerase kettingreactie moeten de volgende elementen: eerste DNA-molecuul, een thermostabiel DNA-polymerase (Taq en Pfu), deoxyribonucleotide fosfaten (stikstofbronnen basen), de primers (2 primer 1 DNA-molecuul) en zich een buffersysteem dat kan verrichten alle reacties.

PCR bestaat uit drie stappen: denaturatie, primer annealing en verlenging.

1. denaturatie. Bij een temperatuur van 94-95 graden Celsius proshodit breken de waterstofbruggen tussen de twee ketens van DNA, en als resultaat hebben we twee enkelstrengige moleculen.

2. getemperd primers. Bij een temperatuur van 50-60 graden Celsius treedt toetreding primers aan de uiteinden van enkelstrengs nucleïnezuurmoleculen volgens de soort complementariteit.

3. Rek. Bij een temperatuur van 72 graden wordt gesynthetiseerd dochter dubbelstrengs desoxyribonucleïnezuur moleculen.

DNA sequencing

Moleculair biologisch onderzoek vereisen vaak kennis van de sequentie van nucleotiden in een molecuul van deoxyribonucleïnezuur. Om het bepalen van de genetische code gesequenced. Moleculaire diagnostiek van de toekomst zal worden gebaseerd op de kennis die is opgedaan bij de bepaling van de menselijke sequentie.

De volgende soorten sequencing:

• sequentiebepaling door de Maxam-Gilbert;
• Sanger sequencing;
• pyrosequencing;
• nanoporovoe sequencing.